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I- Desarrollo del protocolo experimental.
Joaquín V. Rodríguez(1), Luciana L. Almada(1), Angel Scandizzi(1), Edgardo E. Guibert(2), Mario Secchi(3).
(1)Farmacología, Fac. Cs. Bioquim. y Farm. UNR (2)Biología Molecular Fac. Cs.
Bioquim. y Farm. UNR (3)UME, Hospital Italiano de Rosario
mailto:jrodrig@fbioyf.unr.edu.ar
El objeto de este trabajo fue desarrollar un protocolo que permita preservar HC a temperatura subcero sin congelamiento. Basados en la propiedades coligativas de los dioles, se seleccionó el 1,4-butanodiol (BDL) como crioprotector (CP) y la sol. de la Universidad de Wisconsin (UW) como solución base.
Los estudios realizados fueron: a) desarrollo de un método de dosaje de BDL por cromatografía gaseosa, b) se determinaron los puntos de congelamiento de UW + cc. variables del CP para obtener un valor mínimo de temperatura y una osmolaridad tolerable para los HC: con 8 % de BDL la osmolaridad (1.776±22,n=5 Osm/Kg H2O) se correspondió un valor de -4.0 ± 0.2 °C. c) se estimó la penetración celular del CP a 0°C, determinando la conc. de BDL en el volumen acuoso intracelular (3H2O, 14C-inulina): los resultados mostraron que la penetración es proporcional a la conc. extracelular del CP, 1.10 ± 0.15 mg/ml BDL intracelular / 1.0 mg/ml BDL extracelular. d) Se determinó la velocidad óptima de enfriamiento que garantice la no formación de hielo: 0 a - 4.0 °C en 60 min. e) se investigó la remoción del CP de los HC preservados por la técnica de dilución, para ello se determinó la conc. celular de BDL después de realizar lavados en sol. Krebs-Henseleit, (1er lavado <1 % del contenido inicial, 2do lav.- no detectable).
El protocolo desarrollado permite preservar HC a temperaturas subcero en condiciones de un estrés celular mínimo respecto de las técnicas de criopreservación convencionales.
II-Estudios de viabilidad funcional
Luciana L. Almada(1), Sebastián D. Calligaris(1), Edgardo E. Guibert(2), Mario Secchi(3), Joaquín V. Rodríguez(1).
(1)Farmacología. Fac. de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas. UNR. (2)Biología Molecular
Fac. Cs. Bioquim. y Farm. UNR (3)UME, Hospital Italiano de Rosario
lalmada@fbioyf.unr.edu.ar
En el presente trabajo se analizaron los efectos causados por la preservación a temperatura subcero (-4ºC) en solución UW con el agregado de 1,4-butanodiol 8% (UW-BDL), sobre la respuesta funcional de HC, mediante estudios de reoxigenación normotérmica (37ºC-120min-carbógeno).
Se realizaron tres grupos experimentales: I) HC recién aislados (n=3), II) HC preservados 72hs (UW-0ºC-N2) (n=3) y III) HC preservados 120hs [UW-BDL-(-4ºC)] (n=3). Durante la preservación se determinó la liberación de LDH (%LDH), contenido de ATP (nmol/106cél) y Glutation (GSH) (nmol/106cél), no encontrándose diferencias significativas entre los grupos II y III (III: %LDH=6.60±2.60, GSH=56.00.±4.56 ATP=13.21±2.41).
Durante la reoxigenación se estudiaron, además, la eficiencia de destoxificación de amonio (%EDA={([NH4]0h-[NH4]2h)/[NH4]0h}x100) y la reducción de sales de tetrazolium (MTT) (U.A./106cél). A los 120 min, el grupo III disminuyó la capacidad de retener LDH y mantener GSH (I: %LDH=9.9±2.9, GSH=30.25±4.1; II: %LDH=17.7±4.6, GSH=31.75±5.26; III:
%LDH=26.7±0.88*, GSH=18.19±0.83*, Anova p<0.05). Los ensayos funcionales no arrojaron diferencias entre los tres grupos (%EDA: I=40.21±5.13, II=47.91±13.02 y III=40.97±10.45 y MTT: I=13.09±3.04, II=12.03±1.16 y III=10±1.14).
Estos resultados sugieren que la incorporación de 1,4-BDL a la solución UW permite preservar HC a temperaturas subcero durante periodos prolongados de tiempo, manteniendo una viabilidad funcional similar a las células control
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